Thư mục

Hỗ trợ kỹ thuật

  • (Hotline:
    - (04) 66 745 632
    - 0982 124 899
    Email: hotro@violet.vn
    )

Thống kê

  • lượt truy cập   (chi tiết)
    trong hôm nay
  • lượt xem
    trong hôm nay
  • thành viên
  • Chào mừng quý vị đến với Thư viện Bài giảng điện tử.

    Quý vị chưa đăng nhập hoặc chưa đăng ký làm thành viên, vì vậy chưa thể tải được các tư liệu của Thư viện về máy tính của mình.
    Nếu đã đăng ký rồi, quý vị có thể đăng nhập ở ngay ô bên phải.

    Phản ứng sinh hóa kiểm nghiệm vi sinh vật

    (Tài liệu chưa được thẩm định)
    Nguồn: Chưa rõ
    Người gửi: Trần Văn Huỳnh
    Ngày gửi: 00h:12' 18-11-2010
    Dung lượng: 4.2 MB
    Số lượt tải: 561
    Số lượt thích: 0 người
    Các thử nghiệm sinh hóa
    GV: Nguyễn Văn Hạnh
    Chương 4
    Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSV
    Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa.
    Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV:
    Cách truyền thống
    Sử dụng các bộ KIT
    Sử dụng các thiết bị tự động
    Thử nghiệm khả năng lên men
    Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn CH của các VSV
    Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid  giảm pH môi trường
    Các loại carbonhydrate
    Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose …
    Dicarbonhydrate: sucrose, lactose …
    Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose
    Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO
    Các loại đường rượu: chứa chức -OH
    Phenol Red Carbohydrate Broth
    Hấp ở 115oC trong 15 phút
    Trang 104
    Thử nghiệm khả năng lên men
    Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm
    VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH  thay đổi màu chất chỉ thị phenolred
    Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng
    Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ
    Thử nghiệm Citrate
    Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất.
    Cở sở sinh hóa:
    VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm hóa MT
    VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT
    Thử nghiệm Citrate
    Môi trường Simmon citrate agar (tr. 105)

    Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g
    Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g
    NaCl 5g
    Sodium citrate 2g
    MgSO4 0,2g
    Bromothymol blue 0,08g
    Agar 13g
    Thử nghiệm Citrate
    Chú ý
    - Cấy lượng sinh khối vừa đủ
    - Có đối chứng trắng đi kèm
    Thử nghiệm Urease
    Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease
    Cơ sở sinh hoá:
    (NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2
     tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ)
    Môi trường sử dụng:
    Urea Broth (Rustigian – Stuart)
    Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)
    Môi trường Urea Broth
    Thực hiện
    Chuẩn bị môi trường
    Cấy VSV vào 5ml môi trường
    ủ 37oC/24 giờ
    Quan sát
    Thử nghiệm Urease
    Thử nghiệm khả năng sinh H2S
    Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S
    Cơ sở sinh hóa:

    Acid amin chứa S H2S

    Thiosulfate H2S

    H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS)
    desulfohydrase
    thiosulfate reductase
    Thử nghiệm khả năng sinh H2S
    Để phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giống Proteus
    Môi trường sử dụng:
    KIA, TSI (thạch nghiêng)
    SIM, PIA (thạch sâu)
    BSA (thạch đĩa)
    Cấy vsv lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48h)
    Thử nghiệm khả năng sinh H2S
    Đọc kết quả:

    Xuất hiện màu đen trong môi trường
    Không xuất hiện màu đen trong môi trường
    (+)
    (-)
    (+)
    ĐC
    Thử nghiệm khả năng sinh H2S
    (+)
    (+)
    (-)
    Thử nghiệm khả năng sinh Indol
    Mục đích
    Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym tryptophanase
    Chủng VSV
    MT canh trypton
    Thu?c th? Kovac`s
    Pứ dương tính
    Pứ âm tính
    37oC / 24h
    Thử nghiệm khả năng sinh Indol
    Là phản ứng giúp phân biệt
    E. coli (+) với Klebsiella (-)
    Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+)
    Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)

    Đối chứng (+) Proteus rettgeri
    (-) Serratia marcescens
    Thử nghiệm KIA/TSI
    KIA: Kligler iron agar (trang 99)
    Pepton 20g
    Lactose 20g
    Glucose 1g
    NaCl 5g
    Feric ammonium citrate 0,5g
    Sodium thiosulphate 0,5g
    Agar 15g
    Phenol red 0,025g
    Nước cất 1 lít
    pH 7,4±0,2
    Thử nghiệm KIA/TSI
    TSI: Triple sugar iron agar (trang 106)
    Pepton 20g
    Lactose 10g
    Sucrose 10g
    Glucose 1g
    NaCl 5g
    Feric ammonium sulphate o,2g
    Sodium thiosulphate 0,2g
    Agar 13g
    Phenol red 0,025g
    Nước cất 1 lít
    pH 7,4±0,2
    Thử nghiệm KIA/TSI
    Mục đích: phát hiện khả năng
    sử dụng các nguồn cacbonhydrate
    sinh H2S
    tạo hơi (gas)
    Ủ 37oC/24 giờ
    Quan sát:
    Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S
    Thử nghiệm KIA/TSI
    Thử nghiệm MR (Methyl red)
    Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên men glucose.
    Cơ sở sinh hóa:
    Chất chỉ thị pH: methyl red



    MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid
    MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính
     Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC
    Thử nghiệm MR (Methyl red)
    Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth)
    Chủng VSV
    ủ 2 – 5 ngày
    37oC
    Pứ âm tính
    Pứ dương tính
    ĐC
    MR-VP broth
    Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
    Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men glucose
    Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn.
    2 pyruvate acetoin + 2 CO2
    Phức màu hồng
    Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
    Môi trường sử dụng: MR-VP
    Phương pháp tiến hành:
    Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP
    Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC
    Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ
    Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ.
    Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
    Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng
    (+) : Enterobacter cloacea
    (-) : E. coli
    Đọc kết quả:
    (+): màu đỏ trên môi trường
    (-): mặt môi trường không đổi màu
    (+)
    (-)
    Thử nghiệm Bile Esculin
    Mục đích: xác định khả năng thủy giải glucoside esculin thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật.
    Cơ sở sinh hoá:
    Esculin là hợp chất nhân tạo
    Esculetine được phóng thích phản ứng với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đen
    Môi trường Bile Esculine Agar
    Glucose
    Esculetine
    Phân tử Esculine
    Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine
    Thử nghiệm Bile Esculin
    Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+)
    Thử nghiệm Malonate
    Mục đích
    Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng malonate như nguồn carbon duy nhất
    Cơ sở sinh hoá
    Malonate là chất cạnh tranh với succinate
    Khi VSV phân hủy được malonate thì cũng phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác  tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi trường
    Thử nghiệm Malonate
    Môi trường sử dụng:
    Malonate broth (bromothymol blue)

    Dương tính: MT chuyển màu xanh da trời
    Âm tính: MT không đổi màu và không sinh khối
    (+)
    (-)
    ĐC
    Thử nghiệm catalase
    Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzym catalase.
    Cơ sở sinh hoá:
    Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý

    H2O2 H2O + O2 (bọt khí)
    (hydrogen peroxide)
    catalase
    Thử nghiệm catalase
    Thực hiện
    VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)
    Đặt VSV lên lam kính sạch
    Nhỏ H2O2 30%
    Quan sát sau 1-2 giây
    Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
    Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện
    Thử nghiệm catalase
    Thử nghiệm catalase
    Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H2O2 30%
    Thử nghiệm decarboxylase
    Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm carboxyl ở một số acid amin
    Cấu trúc của phân tử
    Amino acid
    3 thử nghiệm quan trọng
    Lysine decarboxylase (LDC)
    Ornithine decarboxylase (ODC)
    Arginine decarboxylase (ADC) / Arginine dehydrolase (ADH)

    Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng, chỉ được tạo ra khi trong môi trường nuôi cấy có cơ chất tương ứng
    Cơ sở sinh hoá
    Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường  đổi màu chất chỉ thị
    Môi trường sử dụng:
    Decacboxylase Basal Medium
    chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8)
    Thử nghiệm decarboxylase
    Biểu hiện sinh hoá
    Dương tính: pH môi trường tăng
    Âm tính: pH giảm
    MT trước khi cấy
    Pứ dương tính
    Pứ âm tính
    Thử nghiệm decarboxylase
    THỬ NGHIỆM COAGULASE
    Mục đích: Thử nghiệm khả năng làm đông tụ huyết tương bởi enzyme coagulase
    Là bước cuối trong định danh các giống Staphylococcus
    Chủng đối chứng (+): S. aureus
    (-): S. epidermidis
    Thử nghiệm tiến hành với huyết tương và fibrinogen.
    THỬ NGHIỆM COAGULASE
    Thử nghiệm bằng 2 cách
    Thử trên phiến kính
    Thử nghiệm trong ống nghiệm:
    0,5ml huyết tương
    0,5ml huyết dịch sinh khối
    Ủ và đọc kết quả mỗi
    30 phút
    THỬ NGHIỆM COAGULASE
    Kết quả thử nghiệm Coagulase
    (+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương
    (-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất
    Thử nghiệm gelatinase
    Mục đích: thử nghiệm khả năng phân giải gelatine bởi gelatinase.
    Cơ sở sinh hóa:
    Gelatine polypeptide + acid amin

    Gelatine trong môi trường dinh dưỡng môi trường đông đặc
    VSV phân hủy gelatine môi trường lỏng
    gelatinase
    Thử nghiệm gelatinase
    Đối chứng dương: Aeromonas hydrophila
    âm: E. coli
    Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine
    Dạng ống nghiệm thạch sâu
    Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng.
    Thử nghiệm gelatinase
    Đọc kết quả
    (+) môi trường tan chảy
    (-) môi trường không tan chảy
    TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
    Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển hoá glucose theo các con đường khác nhau
    Cơ sở sinh hóa:
    Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường acid cao
    Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí
    TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
    Môi trường sử dụng: Oxidation/Fermentation media (Hugh & Leifson media)
    Chỉ thị pH: bromocresol purple
    TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
    TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
    Đọc kết quả:
    A: đối chứng
    B: phản ứng Ôxi hóa
    C: phản ứng lên men
    Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
    Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrate
    Cở sở sinh hóa:
    NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine hydrochloride  chất màu hồng
    NO3 + bụi kẽm  màu hồng
    Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
    Phương pháp tiến hành:
    Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường chứa nitrate
    Bổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện diện của nitrite
    Phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung lượng kẽm nhỏ để định tính nitrate
    Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
    Thử nghiệm oxydase
    Mục tiêu: phát hiện VSV có hệ enzym oxydase (hệ cytochrom C)
    Cơ sở sinh hoá
    Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C ôxi hoá + H2O
    Cytochrom C ôxi hoá + TMPD khử  TMPD ôxi hoá (màu xanh)
    Thử nghiệm oxydase
    Thuốc thử
    TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine
    Bảo quản lạnh trong tối
    Thời hạn bảo quản: 2 tuần
    Đối chứng (+): Serratia marcescens
    (-) : Proteus rettgeri
    Thử nghiệm oxydase
    Thực hiện:
    Lấy VSV từ Nitrient Agar đặt lên giấy thấm
    Nhỏ thuốc thử TMPD
    Quan sát sau 30 giây
    Phản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanh
    Phản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng
    Thử nghiệm oxydase
    Thử nghiệm ONPG
    Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß-galactosidase – enzyme cảm ứng.
    Cơ sở sinh hóa:
    ONPG o-nitrophenol
    Màu vàng
    Không màu
    Thử nghiệm ONPG
    Lactose agar
    Chủng VSV
    2ml ONPG broth
    Pứ (+)
    Pứ (-)
    ủ qua đêm
    37oC
    Màu vàng
    Thử nghiệm khả năng tan huyết
    Mục tiêu: phát hiện các vi sinh vật có khả năng làm tan hồng cầu
    Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ …
    Cơ sở sinh hoá:
    Các heamolysine là các tác nhân làm tan hồng cầu động vật
    Vi sinh vật khác nhau  heamolysine khác nhau  cường độ và biểu hiện tan hồng cầu khác nhau
    Thử nghiệm khả năng tan huyết
    Phân loại: 3 kiểu tan huyết
    Tan huyết hoàn toàn (ß): vòng tan huyết trong, rõ
    Tan huyết không hoàn toàn (α):xung quanhvà dưới khuẩn lạc chuyển đục và có màu khác
    Không tan huyết (ɣ): hoàn toàn không tan huyết
    Thử nghiệm CAMP
    Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan huyết giữa các VSV
    Cơ sở sinh hóa:
    S. aureus tiết β-lysin gay tan hồng cầu
    VSV tiết CAMP gây tan huyết
    β-lysin + CAMP  gây tan huyết mạnh, hoàn toàn
    Ý nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus nhóm B (+) với Streptococcus nhóm khác (-)
    Staphylococcus aureus
    Streptococcus agalactiae
    Streptococcus pyogenes
    (+)
    (-)
    Thử nghiệm tính di động
    Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật.
    Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao
    Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar).
    Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy.
    Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục.
    Thử nghiệm tính di động
    (+)
    (+)
    (-)
    Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV
    Mỗi loài vsv có những đặc tính sinh hóa khác nhau
    Thực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh hóa có thể giúp xác định tên loài (định danh) vi sinh vật đó.
    Bảng sinh hóa dùng định danh các loài vi sinh vật đường ruột (trang 23)
    Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E
    (bioMerieux, Inc)

    No_avatarf

    thầy ơi cho em hỏi, quyển sách thầy sử dụng đề viết tài liệu này tên gì z? em cám ơn!

     
    Gửi ý kiến
    print