SVTH: trần thanh duy
Mssv:09093759



LIỆU PHÁP GEN
NỘI DUNG CHÍNH


1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIỆU PHÁP GEN
2. LIỆU PHÁP GEN VÀ CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG LIỆU PHÁP GEN
2.1. ĐỊNH NGHĨA
2.2. CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG LIỆU PHÁP GEN
3. CƠ SỞ CỦA LIỆU PHÁP GEN

NỘI DUNG CHÍNH
4. VECTOR CHUYỂN GEN CÓ BẢN CHẤT VIRUS
4.1. VECTOR RETROVIRUS
4.2. VECTOR ADENOVIRUS
5. CÁC VECTOR KHÔNG CÓ BẢN CHẤT VIRUS
5.1. PHẦN TỬ TRUNG GIAN CHUYỂN GEN
5.2. LIPOSOMES
6. ỨNG DỤNG CỦA LIỆU PHÁP GEN
NỘI DUNG CHÍNH

1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIỆU PHÁP GEN


Vào ngày 14-9-1990, nhóm nghiên cứu tại học viện sức khỏe quốc gia Mỹ đã tiến hành chuỗi thử nghiệm liệu pháp gen đầu tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tuổi.
Sinh ra với căn bệnh di truyền hiểm nghèo có tên là severe combined immune deficiency SCDI, cô bé thiếu hệ thống miễn dịch và có thể bị tổn thương khi mắc phải bất kỳ mầm bệnh nào.
1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIỆU PHÁP GEN
Bác sĩ đã tách các tế bào máu trắng ra khỏi cơ thể cô, cho chúng phát triển trong phòng thí nghiệm, gắn gen thiếu vào các tế bào này và sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi di truyền trở lại máu của bệnh nhân.
Liệu pháp này đã làm tăng hệ thống miễn dịch của Ashanti.
Từ đó liệu pháp gen được ra đời .

1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIỆU PHÁP GEN


2.1. ĐỊNH NGHĨA
2.2. CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG LIỆU PHÁP GEN

2. LIỆU PHÁP GEN VÀ CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG LIỆU PHÁP GEN

Có rất nhiều định nghĩa, song định nghĩa sau đây được sử dụng rộng rãi nhất trong các diễn đàn quốc tế. Liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành vào cơ thể thay thế cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt được mục tiêu của liệu pháp.

2.1. ĐỊNH NGHĨA



- Biện pháp thứ nhất là cách giải quyết triệt để, vì gen lành sẽ được đưa vào đúng vị trí của nó trên bộ gen và chịu tác động bình thường của các trình tự biểu hiện gen đó
- Biện pháp thứ hai dễ thực hiện hơn nhưng khi đưa thêm một gen cần thiết vào bộ gen, người ta không làm chủ được vị trí gắn xen của đoạn mới đưa vào.

2.1. ĐỊNH NGHĨA

Điều này dẫn đến một số kết quả không lường trước được:
+ Gen mới đưa vào không nằm trong phức hợp điều hoà nên có thể được biểu hịên một cách tuỳ tiện, không đúng nơi (đúng với loại tế bào, mô đặc hiệu) và không đúng lúc (đúng với chu trình phát triển cá thể), hoặc thậm chí không được biểu hiện.
+Gen mới đưa vào gây những hiệu quả không mong muốn.
+Gen gắn vào một vị trí có khả năng hoạt hoá một gen tiền ung thư dẫn dến sự biểu hiện quá độ của gen này gây ra ung thư.


2.1. ĐỊNH NGHĨA

- Các nhóm chuyên gia đã chia liệu pháp gen thành các mức khác nhau:
+ Chuyển gen với sự hoà nhập (gen được kết hợp chặt chẽ với DNA của vật chủ)
+ Chuyển gen không hoà nhập (gen không kết hợp chặt chẽ với DNA của vật chủ)
+ Sử dụng các oligonucleotide tổng hợp nhân tạo gọi là các phân tử ribozyme/antisense không có các thành phần điều hoà (sự biểu hiện gen đã bị biến đổi).

2.1. ĐỊNH NGHĨA

2.2. CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG LIỆU PHÁP GEN
Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển. Trước đó, các virus đã được biến đổi để không còn khả năng sao chép, đồng thời lại có khả năng biểu hiện mạnh gen cần đưa vào cơ thể. Các biến đổi này bao gồm việc loại bỏ các trình tự cần cho sự sao chép của virus và gắn vào trước gen các trình tự promotor mạnh.
Sau đó, vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy. Loại tế bào được sử dụng nhiều nhất là tế bào tuỷ xương vì dễ nuôi cấy lại bao gồm nhiều tế bào nguồn đa thế (pluri potential)

Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta đã tách các tế bào tuỷ xương. Đây là kỹ thuật ghép tự thân dù gen ghép vào là gen lạ đối với cơ thể. Trở ngại lớn là protein do gen lạ tạo ra có thể kích thích sản sinh kháng thể chống lại chính nó, hơn nữa, nếu việc chuyển gen vào tế bào nuôi cấy thường thành công thì việc đưa tế bào chuyển gen trở lại cơ thể lại ít khi có hiệu quả do nhiều nguyên nhân.

2.2. CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG LIỆU PHÁP GEN

3. CƠ SỞ CỦA LIỆU PHÁP GEN



Để chuyển gen, cần hội đủ các điều kiện sau
      Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự điều hoà thích hợp (trình tự khởi động), trình tự khởi động có thể là duy nhất đối với gen đặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biều hiện trong các mô mà thông thường chúng được biểu hiện.
Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích. DNA cần kỹ thuật này để có thể tiếp cận với tế bào.
Ba kỹ thuật cơ bản được sử dụng để làm điều này:
      - DNA có thể được gắn trực tiếp với các tế bào hoặc cấy vào mô. Gọi là chuyển DNA trần (nacked DNA transfer)
DNA có thể được sử dụng để tạo nên con thoi dịch chuyển virus (viral transfer shuttle). Đây là phương pháp chuyển DNA hầu như chắc chắn nhất. DNA xâm nhập không hiệu quả vào tế bào vì nó khó có thể xuyên qua lớp màng lipit kép, nhưng vector virus dễ dàng làm việc này.
- DNA cũng có thể phối hợp với các phức hệ hoá học khác nhau để khuếch đại khả năng chuyển dịch qua màng tế bào của nó.


3. CƠ SỞ CỦA LIỆU PHÁP GEN



Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có thể ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân hoặc trên các tế bào đã tách ra khỏi người bệnh (như tế bào tuỷ xương) sau đó cấy trở lại người bệnh. Trong tương lai, các thao tác liệu pháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi trường mô tế bào và sau đó cấy lên người bệnh sẽ là tiến triển tột cùng.


3. CƠ SỞ CỦA LIỆU PHÁP GEN

Mỗi kỹ thuật trên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng. Khi chọn phương pháp phân phối gen, một số nhân tố cần được cân nhắc:
- Hiệu quả của liệu pháp phải được đặt lên hàng đầu.
- Sau đó, gen chuyển đổi phải được điều hoà đúng đắn. Nó phải được hoạt hoá đúng lúc, với độ dài thời gian chính xác và đúng số lượng.

3. CƠ SỞ CỦA LIỆU PHÁP GEN


4. VECTOR CHUYỂN GEN CÓ BẢN CHẤT VIRUS

Sự sử dụng virus trong liệu pháp gen dựa trên các chức năng cơ bản của nó:
- Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền đến tế bào. Virus chứa vật chất di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus gắn tới các tế bào riêng biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào.



- Sự phụ thuộc vào dạng của vector virus được sử dụng, những gen được mang bởi virus hoặc được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các tế bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế bào, nơi mà các nhiễm sắc thể và DNA nhân tồn tại. Các gen đặc hiệu được mang và được tiếp hợp bởi virus sẽ phiên mã tổng hợp RNA và dịch mã tạo thành protein để tạo nên chức năng mong muốn hay sản phẩm của liệu pháp.


4. VECTOR CHUYỂN GEN CÓ BẢN CHẤT VIRUS

- Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen. Hơn nữa, hiệu quả cuối cùng của chúng đối với các gen chức năng trong tế bào không giống nhau và có thể khác nhau từ tế bào này đến tế bào khác hoặc mô của cơ quan này đên mô cơ quan khác.

4. VECTOR CHUYỂN GEN CÓ BẢN CHẤT VIRUS


Hiện tại, có 4 dạng chính của vector virus đang được sử dụng trong nghiên cứu và ứng dụng: adenovirus, adeno-associate virus (AAV), retrovirus và herpes Simplex.

4. VECTOR CHUYỂN GEN CÓ BẢN CHẤT VIRUS

Bảng 1: So sánh đặc điểm của các hệ thống chuyển gen virus

4. VECTOR CHUYỂN GEN CÓ BẢN CHẤT VIRUS


4.1. VECTOR RETROVIRUS

- Retrovirus nằm trong số các vector virus được phát triển đầu tiên. Vector này đã được sử dụng trong gần 60% dự án liệu pháp gen y học. Virus này có chứa vật chất di truyền là RNA và có kích thước 7 đến 11 kB. Khi vào tế bào, RNA virus cần trở thành DNA trước khi nó có chức năng trên tế bào chủ. Điều này được thực hiện bởi enzim phiên mã ngược, RT (reversse transcriptase). Retrovirus có chứa enzim phiên mã ngược (enzim xúc tác tạo thành bản sao DNA của vật liệu di truyền RNA qua phiên mã ngược) và enzim hoà nhập (integrase) cần cho sự hoà nhập của retrovirus virus vào tế bào chủ.

- Bộ gen của tất cả các virus này nhỏ và đã được nghiên cứu đầy đủ. Retrovirus dễ dàng biến đổi về mặt di truyền do đó được sử dụng rộng rãi như một vector của liệu pháp gen.     
- Các vector retrovirus cơ sở có thể trở thành vector được lựa chọn để thay đổi tế bào gốc (stem sell). Khi đó, liệu pháp gen sẽ được sử dụng để sản xuất các gen chữa bệnh. Tuy nhiên, khi ứng dụng dạng vector này để tách dòng, rủi ro do đột biến sẽ tăng.



4.1. VECTOR RETROVIRUS



- Một trong các phát triển thú vị gần đây là sự biến đổi của các lentivirus, dạng thay thế (sub-type) của retrovirus, trong các ứng dụng của liệu pháp gen. Dạng virus này gồm có HIV và SIV. Các retrovirus này hoà nhập với DNA của tế bào chủ, do đó cung cấp sự biểu hiện gen ổn định trong một thời gian dài. Tuy nhiên, chúng có thể vào các tế bào không phân chia, do đó mở rộng khả năng ứng dụng của vector này


4.1. VECTOR RETROVIRUS






























Hình 2: Chu trình tái bản của retrovirus.



4.1. VECTOR RETROVIRUS




Hình 2: Chu trình tái bản của retrovirus.

Sự nhiễm bắt đầu khi lớp màng glycoprotein của virus nhận ra các vị trí thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, sau đó màng virus và màng tế bào dung hợp giải phóng lõi virus (virus core) vào tế bào chất. RNA của virus, được sao chép thành phân tử DNA mạch kép, và xâm nhập vào nhân.
Thời gian chính xác và cơ chế của việc này chưa được xác định rõ ràng. DNA hoà nhập vào nhiễm sắc thể, bộ gen virus (từ bây giờ gọi là provirus) được giữ ổn định. Sản xuất RNA của virus và sau đó là các protein và enzim của chúng. RNA của virus cũng kết hợp với protein của virus để tạo thành các phần lõi (core) mới. Các virion con đã trưởng thành có khả năng nhiễm vào các tế bào mới khi chúng được giải phóng ra ngoài tế bào và được bao bởi vỏ của  chúng (gồm có màng tế bào và vỏ glycoprotein).     
     
4.1. VECTOR RETROVIRUS

Các gen của virus biểu hiện từ các promoter không có bản chất retrovirus (nonretroviral) và đưa tới các tế bào, nơi chúng bảo tồn được sự ổn định và sản xuất các protein enzim cũng như cấu trúc virus. Khi vector retrovirus được đưa tới tế bào, vector virus RNA cần được bao gói, kết quả từ quá trình sản xuất của các phần tử virus chứa bộ gen vector. Virus này có thể được thu lại và sử dụng để tiêm vào các tế bào đích nhằm đưa gen ngoại lai trong vector tới tế bào. Vì các tế bào đích này không biểu hiện các protein của virus, vector sẽ không truyền bá xa hơn. Các gen của virus trong các tế bào bao gói không mang cấu trúc đi xa hơn vì chúng mất chuỗi cis-acting cần thiết cho sự nhân bản.



4.1. VECTOR RETROVIRUS



Hình 3: sản xuất vector retrovirus.
Liệu pháp gene sử dụng adenovirus. Một gene mới được tiêm vào vector là adenovirus, vector adenovirus được dùng để đưa DNA thay đổi chút ít vào trong tế bào người. Nếu chữa trị thành công, gene mới do vector phân phối sẽ tạo ra protein có chức năng. vector bám vào màng tế bào; DNA thay đổi chút ít được tiêm vào vector;DNA virus; gene mới: vector được bao lại trong túi nhập bào; túi nhập bào vỡ ra giải phóng vector; vector tiêm gene mới vào nhân tế bào người; tế bào dùng gene mới tạo ra protein.



4.1. VECTOR RETROVIRUS




5. CÁC VECTO KHÔNG CÓ BẢN CHẤT VIRUS

- Trong khi sự phát triển và sử dụng các vector virus đã đem lại nhiều hứa hẹn, những giới hạn của nó đã thúc đẩy các nghiên cứu tìm kiếm các vector không có bản chất virus (nonviral vector) trong việc chuẩn đoán và điều trị bệnh.
- Như vector virus, nonviral vector  được sử dụng để gắn các vật chất di truyền, protein hay thuốc chính xác tới tế bào ở người. Sử dụng nonviral vector trên người bệnh đã thu được nhiều thuận lợi rõ ràng. Đáp ứng miễn dịch tăng lên chắc chắn xảy ra ở vector virus được bỏ qua nhờ sử dụng nonviral vector.  

5.1. PHẦN TỬ TRUNG GIAN CHUYỂN GEN

5.2. LIPOSOMES


5. CÁC VECTO KHÔNG CÓ BẢN CHẤT VIRUS


5.1. PHẦN TỬ TRUNG GIAN CHUYỂN GEN


Phần tử trung gian chuyển gen hay gene gun là kỹ thuật mang lại thuận lợi của việc dễ dàng tiếp cận với da. Nó sử dụng lực cơ học để đẩy tới DNA hay protein trong một số trường hợp tạo miễn dịch, trực tiếp tới da của người bệnh.
DNA được gắn vào bề mặt của các quả cầu vàng (đường kính ≤ 1 mm). Vàng không gây ra đáp ứng miễn dịch và là một vector tuyệt hảo để sử dụng cho kỹ thuật này. Phức hệ chứa vàng và DNA sau đó được đẩy tới da. Bio-Rad, Inc (Hercules, CA) hiện hành sản xuất phần tử trung gian chuyển gen Helios sử dụng heli để làm yếu tố thúc đẩy.










(A) Thiết bị Accell gene gun được thiết chế và chế tạo bởi Dr. D. McCabe.
(B) Thiết bị Helios gene gun, được phát triển từ thiết bị của Accell.

5.1. PHẦN TỬ TRUNG GIAN CHUYỂN GEN

(C) Chuyển gen in vitro
vào một cụm lớp tế bào đơn
sử dụng Helios gene gun.

(D) Chuyển gen in vivo
đến mô da lợn
sử dụng Helios gene gun
- Liệu pháp này đã thành công trong ứng dụng điều trị ung thư da và các căn bệnh về da với các khuyết tật di truyền. Đặc biệt là tạo miễn dịch chống lại các khối u ác tính. Các văcxin DNA tiến hành theo hướng kỹ thuật “gene gun” đã được thử nghiệm trên 15 loài động vật đã cho thấy hiệu quả chống lại các bệnh cúm, HIV, sốt rét, lao…
- Các nghiên cứu trung gian cũng đã có thành công ban đầu trong việc sử dụng kỹ thuật “gene gun” để gắn DNA vào các tế bào cơ để sản xuất dystrophin. Kỹ thuật “gene gun” là một ví dụ của vector “cơ học” đã đem lại nhiều hứa hẹn trong phòng và trị bệnh.

5.1. PHẦN TỬ TRUNG GIAN CHUYỂN GEN


5.2. LIPOSOMES


- Liposome là vector không có bản chất virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên của màng tế bào để xâm nhập vào tế bào. Tất cả các vật chất sinh học có cực và thành phần lipid cũng như tính hòa tan nước khác nhau. Thành phần và cấu trúc của nó xác định các tính chất này.
- Liposome là các phân tử không độc, dễ dàng sản xuất với số lượng lớn, khiến chúng trở thành vector rất hiệu quả trong các ứng dụng thương mại. Sự xâm nhập của protein trong vector ngăn cản đáp ứng miễn dịch của vật chủ và chúng không bị nguy hiểm hay bị tiêu diệt bởi các enzim (endonucleases) nội bào.
         

- Một trong các ứng dụng thành công nhất của chuyển gen liposome là điều trị bệnh sơ cứng động mạch.
- So với tất cả các vector không có bản chất virus, chuyển gen liposome có tiềm năng ứng dụng lớn nhất tại thời điểm hiện tại.

5.2. LIPOSOMES

5.2. LIPOSOMES





HVJ liposome gắn với các thụ thể axit sialic trên bề mặt tế bào và kết hợp với các lipid trong màng lipid kép gây ra sự dung hợp tế bào. Do sự dung hợp vỏ của HVJ liposome với màng tế bào, DNA trong HVJ liposome có thể đưa trực tiếp vào tế bào chất.

5.2. LIPOSOMES

Hình 5: Chuyển gen sử dụng HVJ liposome.

- Cấy trực tiếp
+ Sự cấy các DNA trần hay DNA tự do là một ví dụ khác của chuyển gen không có bản chất virus. Trong kỹ thuật này, DNA trần được cấy trực tiếp tới khối u hoặc mô. Phương pháp điều trị này có thể làm giảm trực tiếp sự sản xuất các protein quan trọng cho liệu pháp trị bệnh (ví dụ protein khối u) hoặc có thể gây ra đáp ứng miễn dịch giúp ngăn ngừa bệnh.
+ Kỹ thuật này đã được ứng dụng cho cơ xương trong điều trị các bệnh thoái hoá cơ (như bệnh loạn dưỡng cơ), ngăn cản các bệnh gan do virus (như bệnh viêm gan), và các bệnh tim (như bệnh lỗi sung huyết tim).

NGOÀI RA CÒN CÓ CÁC PHƯƠNG PHÁP


NGOÀI RA CÒN CÓ CÁC PHƯƠNG PHÁP

- Liệu pháp tế bào gốc
+ Chuyển tế bào gốc là kỹ thuật tạo ra đột biến lớn trong khoa học, chính trị và tôn giáo. Vì vậy, việc nghiên cứu chúng là hết sức hạn chế và chỉ diễn ra trên quy mô phòng thí nghiệm.
+ Các tế bào gốc là các tế bào đầu tiên trong cơ thể người. Chúng là các tế bào hoàn toàn giống nhau và hầu như có thể phát triển thành bất cứ tế bào nào ở người.
+ Các tế bào này có thể tách khỏi cơ thể, tinh chế trong phòng thí nghiệm, làm thành các dạng tế bào đặc hiệu khác nhau và sau đó các tế bào này được đưa trở lại vật chủ.

6. ỨNG DỤNG CỦA LIỆU PHÁP GEN


- Bệnh ung thư: bằng cách đưa một gen gọi là p53 vào trong vi khuẩn rồi sau đó tiêm vi khuẩn này vào cơ thể bệnh nhân. Gen này có mặt tự nhiên trong các tế bào khỏe mạnh nhưng bị “khóa lại” hoặc đột biến trong cơ thể của nhiều bệnh nhân. Khi được được vi khuẩn dưa lại vào trong tế bào khối u, gen này kích họat sự tự hủy diệt của chúng, và lập trình các tế bào ung thư tự hủy diệt.


- Chữa bệnh điếc: các nhà khoa học Mỹ vừa phát triển thành công tế bào lông thính giác loại tế bào có vai trò quan trọng trong khả năng nghe của con người và động vật bậc cao. Nếu kỹ thuật này có thể ứng dụng trên người, nó sẽ mở ra triển vọng về một phương pháp mới điều trị bệnh điếc và các chứng suy thính giác ở tuổi già.
- Chữa bệnh đái tháo đường: Tiêm insulin, biện pháp duy trì trạng thái sinh lý cho cơ thể đối với bệnh nhân tiểu đường do thiếu hụt insulin

6. ỨNG DỤNG CỦA LIỆU PHÁP GEN

- Đến nay có 533 thử nghiệm liệu pháp gen diễn ra trên thế giới. Với 407 thử nghiệm diễn ra ở Mỹ, đây là nước dẫn đầu trong các thử nghệm của liệu pháp gen. Trong số 533 thử nghiệm, có 322 thử nghiệm trong điều trị bệnh ung thư, chiếm 62,28%, 37 thử nghiệm trong điều trị HIV chiếm 6,94%, ngoài ra là các thử nghiệm với các bệnh tim mạch, u xơ, SCID (severe combined immune deficiency), chứng máu khó đông...

6. ỨNG DỤNG CỦA LIỆU PHÁP GEN


XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN
CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE