CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ
Kĩ thuật tạo dẫn xuất trong sắc ký khí
NỘI DUNG
Chương I: Giới thiệu kĩ thuật tạo dẫn xuất trong sắc ký khí.
Khái niệm.
Mục đích.
Chương II: Những loại dẫn xuất chính.
Sự silyl hóa.
Sự alkyl hóa và ester hóa.
Sự Acyl hóa.
Dung môi trong sự tạo dẫn xuất
Phương pháp tạo dẫn xuất
Chương III: Một số ví dụ.
Chương I: Giới thiệu kĩ thuật tạo dẫn xuất trong sắc ký khí

Khái niệm
Dẫn xuất là quá trình làm thay đổi thuộc tính hóa học của hợp chất tạo ra một hợp chất mới với thuộc tính phù hợp cho việc phân tích bằng sắc khí khí.
Mục đích
Tăng tính không bền vững của hợp chất bằng cách loại trừ sự có mặt của các nhóm OH, NH và SH.
Việc dẫn xuất hóa giúp tạo nên những pic cân đối và tăng độ phân giải giúp cho việc định lượng được chính xác.
Tăng khả năng dò tìm của detector.
Tăng tính ổn định.
Tăng độ nhaỵ của ECD.
Sơ đồ hệ thống sắc ký khí
CHƯƠNG II: Những loại dẫn xuất chính
Dẫn xuất gồm:
Silyl hóa.
Sự alkyl hóa và ester hóa.
Sự Acyl hóa.
SỰ SILYL HÓA

Khái quát
Hợp chất gốc tạo dẫn xuất sylyl làm cho chất gốc dễ bay hơi hơn, ít phân cực hơn và nhiệt ổn định hơn.
Detector dễ dàng thu nhận tín hiệu hơn.
Sản phẩm silyl hóa là dẫn xuất của silyl, không ốn định, và bền nhiệt
Khả năng phản ứng của những nhóm chức theo hướng silyl hóa theo thứ tự
SỰ SILYL HÓA
Khả năng phản ứng của alcohols:


Cơ chế của phản ứng:
Ưu khuyết điểm của sự silyl hóa

Ưu điểm
Khả năng silyl hóa nhiều trạng thái khác nhau của hợp chất
Thuốc thử silyl hóa có sẵn với số lượng lớn
Chuẩn bị dễ dàng
Khuyết điểm
Thuốc thử silyl hóa dễ bị hỏng do có chứa nước
Phải sử dụng aprotic (không có sẵn proton) dung môi hữu cơ.
Các tác nhân silyl hóa
HMDS (Hexamethyldisilzane)
Cấu trúc đối xứng
Dễ dàng để tạo silyl hóa với những nhóm hydroxyl
Có thể kết hợp với TMCS
TMCS
(Trimethylchlorosilane).
Mùi nhẹ, thường chỉ sử dụng một lần.
Chất xúc tác để làm tăng khả năng tạo mùi của TMS
Tạo sản phẩm phụ không có lợi, HCl.
Xúc tác được sử dụng để làm tăng phản ứng của những thuốc thử cho sự silyl hóa
TMSI (Trimethylsilylimidazole).
Phản ứng với nhóm hydroxyl, không có ảnh hưởng đến nhóm amine
Tạo dẫn xuất ở vị trí nhóm cacboxyl của amino axit, và tách tạo thành nhóm amino tự do thay thế cho dẫn xuất fluorinated (ECD)
Dẫn xuất cho những mẫu đường ướt, những nhóm hiđroxyl cản trở trong steroid và amino acid trong flo hóa thuốc thử acyl hóa.
Các tác nhân trong sự Silyl hóa
Các tác nhân sylyl hóa
BSA (Bistrimethylsilylacetamide).
Thuốc thử này được sử dụng khá phổ biến
Tác nhân silyl hóa – acetamide là nhóm xuất tốt
Phản ứng ở điều kiện bình thường và sản phẩm khá ốn định
Tạo dẫn xuất bền hơn TMS, được dùng cho các hợp chất hữu cơ đa chức và điều kiện phản ứng rất êm dịu.

BSA
Các tác nhân silyl hóa
BSTFA (Bistrimethylsilyltrifluoroacetamide)
BSTFA là chất có khả năng bay hơi tốt
Nó có thể hoạt động như một dung môi độc lập
Đốt cháy sản phẩm silicon trifluoride, bảo vệ detectors
MSTFA (N-methyl-trimethylsilyltrifluoroacetamide)
TMS-acetamides hầu hết tạo tính dễ bay hơi.
Hữu ích trong việc phân tích những lượng nhỏ chất dễ bay hơi
TMS-DEA (Trimethylsilyldiethylamine).
Thuốc thử được sử dụng để tạo dẫn xuất cho các amino acid và carboxylicacids
Tạo hợp chất có chướng ngạy lập thể
Phối hợp trong silyl hóa

BSTFA:TMCS:TMSI:Pyridine (3:2:3:10)
BSTFA:TMCS:TMSI: (3:2:3)
HMDS:TMCS:Pyridine (2:1:10)


Dẫn xuất cho những hợp chất có chướng ngạy lập thể
Phản ứng với carbohydrates, hydroxy- và keto-steroids, axit béo, vài amin và amide.
Sự tạo dẫn xuất nhanh và hoàn thành trong vài phút.
Phản ứng với những carbohydrates, hydroxy- và keto-steroids, acid béo, một vài amines và amide
Tạo dẫn xuất bền, hoàn thành trong thời gian ngắn

Sự ACYL Hóa

Khái quát
Sự acyl hóa làm yếu đi sự phân cực của các nhóm amino, hydroxyl, và thiol và thêm vào nhóm chức halogenated thay cho ECD. So với tác nhân silyl hoá thì tác nhân acyl hóa phân cực tốt hơn, hợp chất đa chức, như các carbohydrates và amino acids.
Ưu khuyết điểm của acyl hóa

Ưu điểm
Tăng khả năng phát hiện bằng ECD.
Tăng độ nhạy đối với những phân tử có khối lượng phân tử lớn.
Dùng để hoạt hóa cacboxylic acid trước khi ester hóa (akyl hóa).
Khuyết điểm
Khó khăn trong việc chuẩn bị để tạo dẫn xuất.
Sản phẩm phụ của phản ứng cần phải được tách ra trước khi phân tích.
Những tác nhân Acyl hóa thì dễ bị hỏng do hơi ẩm.
Những thuốc thử thì độc và có mùi khó chịu.
Các tác nhân acyl hóa

Fluorinated Anhydrides:
TFAA- Trifluoroacetoic Anhydride
PFPA- Pentafluoropropionic Anhydride
HFBA- Heptafluorobutyric Anhydride
Phù hợp cho cả hai FID và FCD
Thuốc thử với alcohols, amines, and phenols để ra chất ổn định và những dẫn xuất có khả năng bay hơi cao
Sản phẩm phụ acid có thể được tách dễ dàng.
Khả năng điều chỉnh thời gian lưu trong ECD
Thường dùng tốt trong ECD
Dẫn xuất HFBA dễ làm hư hỏng ECD
Dẫn xuất PFPA phụ thuộc vào nhiêt độ phân tích thấp
TFAA dể phản ứng và bay hơi tốt với anhydrides
Các tác nhân acyl hóa
Fluoracylimidazoles
TFAI- Trifluoroacetylimidazole
Thường được chọn làm dẫn xuất ECD
Phản ứng êm dịu và những sản phẩm phụ như: imidazole, không có tính acid nên không ảnh hưởng đến cột
Phản ứng tốt với các hợp chất như amines và hydroxyl
Dễ tạo dẫn xuất với các phenols, alcohols và amines phù hợp với ECD.
MBTFA-N-Methyl-bis(trifluoroacetamide)
Phản ứng nhanh ở điều kiện thường với các amine bậc 1 và bậc 2, phản ứng chậm đối với các alcohols, phenols và thiols
Tác dụng tốt trong phân tích đường
Điều kiện phản ứng êm dịu và sản phẩm phụ tương đối trơ và không có tính acid
Các tác nhân acyl hóa
PFBCI- Pentafluorobenzoyl Chloride
Dễ phản ứng với phenol.
Được sử dụng làm dẫn xuất của alcohols và amin bậc hai.
PFPOH (Pentafluoropropanol): 2,2,3,3,3-Pentafluoropropanol
Sử dụng phối hợp với PFPA để tạo dẫn xuất tốt nhất cho các nhóm chức, đặc biết là các hợp chất sinh học có nhiều nhóm chức
Tạo dẫn xuất phù hợp với ECD
SỰ ALKYL HÓA VÀ ESTER HÓA

Khái quát:
Sự alkyl nhằm làm giảm tính phân cực của phân tử bằng cách thay thế những hydrogen hoạt động với nhóm alkyl
Alkyl hóa có thể được sử dụng riêng để tạo dẫn xuất cho những esters, ethers và amides hoặc có thể sử dụng cùng với quá trình alsyl hóa hoặc quá trình silyl hóa.
Sự ester hóa phản ứng của một acid với một alcohol trong sự có mặt của chất xúc tác tạo ra một ester. Tác nhân alkyl hóa có thể dùng được trong những dạng khác nhau và tạo ra những ester khác nhau, alkyl ester bền vững và hình thành rất nhanh.
Các tác nhân Alkyl và Ester hóa

DMF (dialkylacetals)
Thuốc thử này phản ứng nhanh tạo dẫn xuất nhờ vào sự hòa tan. Thích hợp cho sự tạo alkyl nhanh
Sự khác nhau của gốc alkyl cho phép hình thành những ester khác nhau, tính phân cực và tính dễ bay hơi của các mẫu có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thời gian phản ứng
DMF sẽ phản ứng với nước cho alcohol tương ứng.
TBH (tetrabutylammonium hydroxide)
Hình thành từ butyl ester, sẽ cho phép thời gian phản ứng ngắn hơn
Thông thường sử dụng cho phân tử nhỏ có tính axit
Các tác nhân Alkyl và Ester hóa
Boron trifluoride in methanol or butanol
Phương pháp thuận tiện và kinh tế cho sự tạo thành ester
PFBBr (Pentafluorobenzyl bromide)
Ester hóa những phenols, thiols, và carboxylic acids
Tạo những alkyl ester có khả năng bền vững và có thể được tách riêng và bảo quản trong một thời gian dài.
Ưu-khuyết điểm của sự alkyl hóa

Ưu điểm
Thuốc thử cho sự alkyl hóa dễ dàng tìm được
Điều kiện phản ứng có thể thay đổi từ tính axit mạnh đến tính bazo mạnh.
Một vài phản ứng có thể thực hiện trong dung môi nước.
Sự dẫn xụất alkyl hóa thì hầu hết là bền
Khuyết điểm
Không phù hợp đối với amin và những nhóm hydroxyl có tính axit
Phản ứng trong điều kiện phải kiểm xoát thường xuyên
Các thuốc thử thường độc
Dung môi cho sự tạo dẫn xuất
Phương pháp tạo dẫn xuất
Phương pháp tạo dẫn xuất
Chương III: Một số ví dụ
Xác định hàm lượng cloramphenicol trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký khí (TCN 186 : 2003 )
Công thức:
Nguyên tắc và sự tạo dẫn xuất
Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định hàm lượng cloramphenicol (sau đây gọi tắt là CAP) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng hệ thống sắc ký khí (sau đây gọi tắt là GC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 mg/kg.
Nguyên tắc
CAP trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng etyl axetat. Dịch chiết sau đó được cô cạn, cặn được xử lý với sylon (chất tạo dẫn xuất trimetylsylyl), để tạo dẫn xuất trimetylsylyl của CAP. Hàm lượng dẫn xuất CAP được xác định trên hệ thống GC với đầu dò bắt giữ điện tử (sau đây gọi tắt là ECD) theo phương pháp nội chuẩn
Tạo dẫn xuất Sylyl
Thêm 100 ml Sylon (Tác nhân tạo dẫn xuất Trimetyl silyl: Sylon HTP kit) vào cặn trong ống ly tâm, đóng nắp rồi lắc mạnh trên máy rung trộn mẫu . Ðặt ống ly tâm vào trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 550 C trong 40 phút. Làm bay hơi dung dịch trong ống cho đến gần khô (lưu ý không để khô hoàn toàn) dưới dòng nitơ tại nhiệt độ trong phòng. Thêm 500 ml toluen rồi lắc mạnh cho tan cặn hoàn toàn.
Chương III: Một số ví dụ
THƯỜNG QUY KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH 3-MONOCLO PROPAN 1,2-DIOL (3-MCPD) TRONG MỘT SỐ LOẠI NƯỚC CHẤM GIA VỊ .
(52 TCN - TQTP 0010 : 2005 do Viện Vệ sinh y tế công cộng biên soạn, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm đề nghị, Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành theo Quyết định số 10 /2005/QĐ-BYT, ngày 25 tháng 03 năm 2005.)
Công thức 3-MCPD
Hàm lượng 3-MCPD cho phép của Bộ Y Tế
Theo tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế VN, ban hành ngày 23/5/2005 sau ba năm nghiên cứu là:
hàm lượng của 3-MCPD có trong xì dầu không thể vượt quá
1mg/Kg áp dụng cho xuất cảng, và giao động từ 3-5 mg/Kg cho việc tiêu dùng trong nội địa. Trong lúc đó tiêu chuẩn của LH Âu Châu là 0,02 mg/Kg, của Anh Quốc 0,2 mg/KG, Bỉ 0,5 mg/Kg. Qua các tiêu chuẩn trên, quả thật chúng tôi không thể hiểu tại sao BYT Việt Nam lại có hai quy định riêng rẽ cho xì dầu xuất cảng và xì dầu nội địa. Chẳng lý nào người dân VN có sức đề kháng với hóa chất trên cao hơn người ngoại quốc?.


(Theo trang web: http://cdc-vn.org/files/HoaChatTrongThucPhamVa_TraiCay.pdf
Chủ đề : Hóa Chất Trong Thực Phẩm Và Trái Cây Tại VN
Tác giả: Mai Thanh Truyết (VNN)).

Nguyên lý và dẫn xuất hóa
Nguyên lý
Mẫu được cho hấp phụ qua cột extrelut, giải hấp 3-MCPD bằng dietyl ête. Sau đó cho tạo dẫn xuất với dung dịch acid toluen-4-sulfonic trong aceton thành
4-(clometyl)-2,2-dimetyl-1,3-dioxolan, phản ứng này được thực hiện tại 400C, trong 90 phút. Sau đó đo trên máy sắc ký khí với detector khối phổ (GC/MS).
Giới hạn phát hiện của phương pháp: 4,01 ppb; Giới hạn định lượng: 13,37ppb.
Dẫn xuất hóa
Dùng pipet hút chính xác 2ml dung dịch acid Toluen-4-sulfonic trong aceton (1g/L) vào bình cầu cất, lắc đều rồi chuyển toàn bộ dung dịch này vào ống nghiệm có nút. Đặt ống nghiệm vào bếp cách thủy ở 400C trong 90 phút, lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng, sau đó chuyển vào chai 1,5ml để đo trên máy GC/MS (dịch thử).
Xin chân thành cảm ơn sự quan tâm theo dõi của các bạn!