Công nghệ chuyển gene thực vật
1
NGUYỄN QUỐC ANH
nguyenquocanh.iuh@gmail.com
Nội Dung
1/. Khái quát về thực vật biến đổi gene (GMP)
2/. Các bước biến nạp gene vào thực vật
3/. Các phương pháp biến nạp gene vào thực vật
4/. Thành tựu và hướng nghiên cứu
2
3
2.3.1 THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN (GMP)
Gạo vàng giàu vitamin A (gạo có chứa beta-carotene)
Hoa hồng màu xanh ( được tạo ra bằng cách thêm vào gene Iris cho cây hồng)
2.3.1 THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN (GMP)
GMP ( Genetically Modified Plant)
GMP: Là thực vật mà vật liệu di truyền của chúng bị biến đổi thông qua việc can thiệp bằng các kỹ thuật di truyền
4
Khái quát về quá trình biến nạp
Tế bào chất
Gen được chọn
www.encarta.msn.com
Vi khuẩn
NST của vi khuẩn
5
2.3.2 Các bước của quá trình biến nạp gene
4. Biến nạp gene vào thực vật
6
Chọn lựa gene, đoạn gene cần thiết
2. Cắt đoạn gene cần thiết
3. Chuyển đoạn gene cần thiết đó vào sinh vật khác
1. Chọn đoạn gene cần thiết
(a) Cô lập gene cụ thể từ những sinh vật cho gene
7
Phá vỡ tế bào
Bổ sung những đoạn gen dò tìm (Genetic probe)
Phát hiện vị trí của các gene cần quan tâm
1. Chọn đoạn gene cần thiết
8
(b) Phân lập plasmid từ tế bào vi khuẩn
www.sci.sdsu.edu
2. Cắt đoạn gene cần thiết
Enzyme cắt giới hạn hoạt động như những cây kéo phân tử và cắt DNA ở những vị trí cụ thể được gọi là vị trí cắt giới hạn (restriction sites)
9
Clipartguide.com
2. Cắt đoạn gene cần thiết
10
2. Cắt đoạn gene cần thiết
11
3. Chuyển gene vào tế bào vi khuẩn
12
Enzyme DNA ligase nối những điểm kết thúc lại với nhau
DNA cho với những điểm kết thúc
Plasmid DNA với những điểm kết thúc
3. Chuyển gen vào tế bào vi khuẩn
13
Enzyme DNA Ligase nối những điểm kết thúc lại với nhau
Next slide for animation
www.gch.ulaval.ca
DNA tái tổ hợp
DNA Ligase
14
3. Chuyển gen vào tế bào vi khuẩn
DNA tái tổ hợp được đưa vào tế bào vi khuẩn
15
Gen được khép kín
4. Biến nạp gene vào thực vật
Tế bào vi khuẩn được nhân lên theo công thức nhị phân Fission (Binary Fission)
16
Tế bào vi khuẩn sản xuất polypeptide
Mã hóa các gen hoặc protein từ DNA cử sinh vật cho gen
Tóm tắt các bước
17
1. Cắt với enzyme cắt giới hạn
2. Enzyme Ligase nối các điểm kết thúc lại với nhau
DNA tái tổ hợp
2.3.3 Một số phương pháp chuyển gen
2.3.3.1 Chuyển gen gián tiếp
a. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens
Nguyên lý
Sử dụng Ti plasmid của Agrobacterium tumefaciens làm vector.
Ti plasmid gồm hai thành phần:
T – DNA chứa gen điều hòa sinh trưởng cục bộ, gen tổng hợp các chất Opine và gen gây khối u, có khả năng xâm nhập vào DNA thực vật.
Vùng vir làm tăng tần số biến nạp.


18
Tạo cà chua biến đổi gen
19
(1) Sao chép một đoạn gen từ cà rốt
(2)Chèn đoạn gen vào một plasmid
(3) Plasmid này lại được đưa vào Agrobacterium
(4) Agrobacterium chuyển đoạn gen của cà rốt vào các TB cà chua nằm trên đĩa petri.
(5)TB cà chua này tiếp tục sinh trưởng và chuyển sang môi trường có chứa hormone kích thích sự mọc rễ và chồi
(6) Gen từ cà rốt đã làm biến đổi sắc tố của cà chua thành màu của beta – carotene, tạo ra cà chua có giá trị cao
Nguyên lý
Hệ gen của virus phải là DNA.
Virus có khả năng di chuyển từ TB này sang TB khác qua các lỗ ở vách TB.
Có khả năng mang được đoạn DNA mới, sau đó chuyển vào TB thực vật.
Có phổ kí chủ rộng.
Không gây tác hại đáng kể cho thực vật.
20
b. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus
21
22
Chuyển gen bằng phương pháp hóa học
Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm
Chuyển gen bằng vi tiêm
Chuyển gen bằng xung điện
Chuyển gen bằng súng bắn gen
Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn
2.3.3.2 Phương pháp chuyển gen trực tiếp
a. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)
Nguyên lý
Ngâm những vi đạn với dung dịch có chứa đoạn DNA ngoại lai cần chuyển.
Các vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng.
Đĩa này được gắn vào đầu một viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen.
Khi bắn, viên đạn lớn bị giữ lại còn vi đạn xuyên vào TB.
Sau khi bắn, tách các mô, TB và nuôi cấy invitro để tái sinh cây.

23
2.3.3.2 Phương pháp chuyển gen trực tiếp
Súng bắn gen
Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen
24
25
26
b. Chuyển gen bằng xung điện
Xung điện ngắn
Tế bào
Màng TB
Xuất hiện lỗ tạm thời
DNA chui vào trong TB
Sau khi biến nạp, tách những enzym phân giải và để cho TB phát triển, thành TB mới được tạo nên.
Các TB này được nuôi cấy trên các môi trường thích hợp kích thích sinh trưởng tạo nên cây hoàn chỉnh.
Sau đó sử dụng các phương pháp phân tích genome để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen.
Nhược điểm: chưa chắc chắn có sự biến nạp
27
c. Chuyển gen bằng vi tiêm
Sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để đưa DNA những TB nhất định nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ protoplast (TB trần) và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn.
Nguyên lý
Tối ưu lượng DNA đưa vào TB.
Quyết định được đưa DNA vào loại TB nào.
Có thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được.
Có thể nuôi riêng lẻ các TB vi tiêm và biến nạp được vào mọi giống cây.
Mỗi lần tiêm chỉ được một phát và một TB.
Thao tác đòi hỏi độ chính xác cao.
Ưu điểm
Nhược điểm
Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền phù khoảng 3mm.
Đem TB trần nuôi cấy trong môi trường thích hợp và chọn ra TB trần được chuyển gen.
28
Tạo TB trần
Plasmid tái tổ hợp
(mang gen mong muốn)
d. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm
Nguyên lý




Dung dịch huyền phù
Nguyên lý





29
e. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học
Gen
TB trần
Polyethylen glycol (PEG).
Khi có mặt PEG màng của TB trần bị thay đổi và TB trần có thể thu nhận DNA ngoại lai.
Ưu điểm
Cùng một lúc chuyển gen được vào nhiều TB.
Nhược điểm
Tần số chuyển gen rất thấp.
Nguyên lý
30
Ưu điểm
Tần số chuyển gen cao.

DNA ngoại lai
Đầu ống phấn
Bầu nhụy
Thời gian chuyển gen tốt nhất khi quá trình thụ tinh xảy ra ở noãn và cho hợp tử chưa phân chia.
Phân tích và xác định kết quả chuyển gen ở thế hệ sau.
Hợp tử
Nhược điểm
Khó xác định được thời điểm chuyển gen
f. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn
2.3.4.1. Các hướng nghiên cứu
a. Chuyển gen kháng nấm gây bệnh


31
Chuyển hai gen chitinase và glucanase (làm thoái hóa các thành phần chính của vỏ TB nấm) giúp tăng tính kháng nấm gây bệnh
Thuốc lá
Cà chua
2.3.4 Các hướng nghiên cứu và thành tựu trong GMP
Chuyển gen sản xuất protein làm giảm độc tố của VK
b. Chuyển gen kháng các vi khuẩn gây bệnh
gen lysozyme từ TB động vật hoặc từ thực khuẩn thể T4 đưa vào cây thuốc lá và khoai tây => Phòng trừ VK Erwina carotovora
Cây thuốc lá chuyển gen kháng virus CMV và đối chứng
33
34
Đu đủ chuyển gen kháng virus
Đu đủ đối chứng
35
Cà chua chuyển gen kháng vật kí sinh (phải) và cà chua đối chứng (trái)
c. Chuyển gen kháng côn trùng phá hoại
36
Bacillus thurigensis
protein ᵹ - endotoxin tinh thể
Cry
Côn trùng
Kiềm
độc tố
hoạt động
các receptor đặc trưng
Chết
Các cây trồng như bông, ngô, khoai tây đã được chuyển gen này để tạo ra tính kháng với côn trùng loại nhai – nghiền.
37
Ngô (Bt corn) mang gen Bt (chống sâu hại)
Thuốc diệt cỏ glyphosat là thuốc có tác dụng diệt cỏ tốt nhất và ít gây ô nhiễm môi trường. Thuốc kìm hãm sự hoạt động của enzym enol pyruvat sikimat phosphat (EPSPS).
Enzym này chuyển hóa sản phẩm quang hợp thành acid sikimic.
Acid sikimic không được hình thành sẽ làm rối loạn toàn bộ quá trình trao đổi chất của cỏ và làm cỏ chết.
Cây trồng được tạo ra có hàm lượng và hoạt tính của enzym EPSPS cao gấp 4 lần so với cây trồng bình thường và cây hoàn toàn chống chịu được với thuốc diệt cỏ glyphosat.
38
d. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
39
EPSPS
Acid sikimic
Cỏ
EPSPS
Acid sikimic
Cỏ
Thuốc diệt cỏ
=> Tạo giống cây trồng có hàm lượng EPSPS cao để kháng thuốc diệt cỏ.
d. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
Tạo ra các dòng gen ở cây đậu tương hoặc ngô mà các gen này mã hóa cho protein giàu các acid amin (lysine, methionine, threonine và tryptophan).
VD: chuyển gen mã hóa cho một loại protein chứa các acid amin có lưu huỳnh cao bất thường vào cây đậu lupin với mục đích biểu hiện ở hạt. Kết quả làm tăng 100% hàm lượng protein trong hạt. Hạt này dùng để nuôi cừu tăng trọng 7% và sản lượng lông tăng 8% so với cừu nuôi bằng loại hạt bình thường.
40
e. Chuyển gen cải tiến các protein hạt
Những gen mã hóa cho protein được gắn với một promotor và đảm bảo cho protein chỉ được tổng hợp ở rễ. Tiếp theo, protein tạo thành có một hệ thống tín hiệu đảm bảo cho nó được vận chuyển vào một vị trí xác định trong TB. Trong trường hợp đặc biệt, protein được vận chuyển vào mạng lưới nội chất (ER).
Protein đi vào có thể được thải ra bên ngoài và chỉ ở vùng rễ, vì promoter chỉ đặc hiệu cho vùng này. Người ta dùng một số dung dịch muối để tách protein một cách dễ dàng với giá thành hợp lý.
41
f. Chuyển gen sản xuất các loại protein mới
Chuyển gen mã hóa protein động vật vào thực vật để sản xuất protein thực vật.
VD: chuyển gen tổng hợp lactoferrin (protein trong sữa động vật) vào khoai tây, lúa làm chúng có khả năng tổng hợp lactoferrin.
Chuyển gen để sản xuất “thực phẩm chức năng”: chuyển các gen tổng hợp các protein có tác dụng như các kháng nguyên vào cây trồng (rau, đậu, cây ăn quả). => Các cây này tạo được vaccin
=> Ăn cây trồng chuyển gen tạo vaccin thay thế cho việc tiêm vaccine phòng bệnh.
42
f. Chuyển gen sản xuất các loại protein mới
Thực phẩm chức năng
43
Chuyển một phức hợp gồm gen rolC của A. tumefaciens và promoter CaMV 35S (cauliflower mosaic virus: virus gây bệnh khảm ở súp – lơ) vào cây thuốc lá và đã thu được cây chuyển gen bất thụ.
Kết quả này đang được nghiên cứu và áp dụng trên nhiều cây khác.
44
g. Chuyển gen mang tính bất thụ đực
Gần đây, các nhà nghiên cứu của ĐH Bristol (Anh) đã thông báo về việc sản xuất hai chuỗi dài acid béo không tạo cholesterol với số lượng lớn ở thực vật bậc cao.
VD: chuyển gen vào cây Arapidopsis thaliana tạo ra được các acid béo thiết yếu như arachidonic acid và eiconsapentaenoic acid.
45
h. Chuyển gen để sản xuất các acid béo thiết yếu
Cây mù tạt Ấn Độ (Brassica juncea) vốn có khả năng kháng và hấp thụ selen (độc với thực vật ở hàm lượng cao). Khi chuyển thêm gen tạo enzym đói selen vào làm cây này hấp thụ selen cao 3,4 lần.
Tuy nhiên, khả năng cây chuyển gen này sẽ lai với các loại hoa màu khác là một điều đáng lo ngại.
46
i. Làm sạch đất ô nhiễm
Chuyển gen vào đậu tương và ngô làm cây có:
Hàm lượng dầu cao hơn, cung cấp nhiều năng lượng hơn cho bò, lợn và gia cầm.
Hàm lượng các loại amino acid không thay thế cao hơn.
Tăng hàm lượng phosphore trong thức ăn chăn nuôi.
47
k. Làm thức ăn chăn nuôi
Các sắc tố tạo màu sắc hoa được chứa trong mô của cánh hoa nhất là TB biểu bì.
Có 3 nhóm anthocyanin cơ bản tạo ra màu sắc hoa: dẫn xuất của các chất pelargonidin, cyanidin và delphinidin.
Trên cơ sở biết gen mã hóa cho các enzym tham gia vào biến đổi sắc tố, người ta đã chuyển gen mã hóa hoặc gen ức chế hoạt động của các enzym nhằm điều khiển hướng chuyển hóa sắc tố tạo ra hoa có nhiều màu sắc khác nhau.
48
l. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc
Đa dạng màu hoa
49
Bông cải chuyển gen
Ngoài ra, còn có các hướng khác:
Chuyển gen chịu lạnh
Một loại gen chống giá rét lấy từ cá nước lạnh đã được cấy vào một số cây trồng.
=> cây trồng có thể chịu được nhiệt độ thấp.
50
Bông chuyển gen chống lạnh
Chuyển gen chịu hạn/chịu mặn
Tạo ra cây trồng có khả năng chịu đựng thời kỳ hạn hán dài ngày hoặc lượng muối cao trong đất và nước ngầm sẽ giúp ích rất nhiều cho nông dân.
51
Lúa biến đổi gen trồng trên đất mặn cho năng suất cao
2. Một số thành tựu
a. Các cây trồng quan trọng đã được phát triển
52
53
54
Giống lúa vàng giàu vitamin A
Đu đủ chuyển gen kháng virus
55
“ Siêu cà chua” đẩy lùi ung thư
Cây thuốc lá có thể làm nhiên liệu
Ở Việt Nam hiện có 3 cây biến đổi gen đang tồn tại là lúa, ngô, bông. Từ năm 2002 đã chuyển hướng sang cải tạo những cây lấy củ (khoai, sắn). Đi xa hơn có các công trình như cây bông kháng sâu, cây đu đủ kháng bệnh đốm vòng, chuyển gen tổng hợp carotene vào cây lúa hay công trình lúa kháng sâu.
56
b. Các loại cây trồng đang được phát triển
57
Nguy cơ tiềm ẩn của thực vật chuyển gen
58